Como se mede a expressão gênica: do RNA ao qRT-PCR

Quando digo que um gene está “mais expresso” em um animal do que em outro, o que exatamente estou medindo? E como se coloca um número nisso? Essa é a espinha dorsal do meu trabalho de mestrado — e vale a pena abrir a caixa-preta.

Expressão gênica é a atividade de um gene: quanto dele está sendo transcrito em RNA mensageiro (mRNA) num determinado tecido e momento. Medir expressão é, portanto, quantificar mRNA. Como o RNA é frágil, o primeiro passo é uma extração cuidadosa, seguida da transcrição reversa — uma enzima converte o mRNA em cDNA, uma cópia estável de DNA.

Com o cDNA em mãos, entra a PCR quantitativa em tempo real (qRT-PCR). A PCR amplifica exponencialmente uma região-alvo; o “tempo real” significa que medimos a quantidade de produto a cada ciclo por meio de um sinal de fluorescência. O ciclo em que esse sinal ultrapassa um limiar de detecção é o Ct (cycle threshold): quanto mais mRNA havia no início, menos ciclos são necessários — ou seja, quanto menor o Ct, maior a expressão.

Mas um Ct isolado não diz muito. Para comparar amostras usamos a quantificação relativa pelo método ΔΔCt, que normaliza o gene de interesse contra genes de referência (housekeeping) — genes de expressão estável entre as condições. Escolher bons genes de referência é uma das decisões mais críticas do experimento; uma normalização ruim distorce todo o resultado.

O qRT-PCR é preciso e sensível, mas mede poucos genes por vez. Quando a pergunta é global — quais genes, entre dezenas de milhares, estão diferencialmente expressos? — recorremos ao RNA-seq, o sequenciamento do transcriptoma completo. Foi assim que combinei descoberta em larga escala e validação alvo a alvo no estudo do Nelore.

Medir expressão gênica é traduzir a atividade invisível do genoma em números com os quais se pode decidir.

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